Диагноз инсулиномы ставят, если во время приступа гипогликемии натощак отмечается нормальный или повышенный уровень инсулина в плазме. Определяют уровень инсулина в плазме методом РИА. Наиболее информативно определение инсулина во время приступа гипогликемии ; диагноз не вызывает сомнений, если на фоне гипогликемии (при концентрации глюкозы в крови меньше 1,7 ммоль/л) уровень инсулина в плазме больше 72 пмоль/л; обычно уровень инсулина превышает 144 пмоль/л. В редких случаях опухоль удается визуализировать с помощью КТ или МРТ. УЗИ выявляет только очень крупные солидные инсулиномы. Характерный признак этой опухоли, растущей из бета-клеток, - гипогликемия , вызванная избытком инсулина . 

Для диагностики также применяют пробу с голоданием. Исследование проводят под наблюдением врача. Больного лишают пищи на срок до 72 ч, при необходимости в конце исследования добавляют физическую нагрузку. У большинства больных гипогликемия развивается в первые 24 ч исследования, при этом у мужчин уровень глюкозы в плазме становится ниже 2,8 ммоль/л, у женщин - ниже 2,5 ммоль/л. Однако сама по себе гипогликемия не является диагностическим критерием инсулиномы; необходимо доказать, что секреция инсулина при этом не подавляется либо усиливается.

Повышение уровня кортизола позволяет исключить гипогликемию, обусловленную болезнями гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы . Нужно также исключить и другие причины гипогликемии голодания - злоупотребление инсулином и пероральными сахаропонижающими средствами , тяжелую печеночную недостаточность , ИФР-секретирующую опухоль ( фибросаркому , мезотелиому , гемангиоперицитому ). Поскольку экзогенный инсулин подавляет секрецию эндогенного инсулина, нормальный или повышенный уровень С-пептида на фоне гипогликемии исключает злоупотребление инсулином. В клетках инсулиномы обычно нарушен процессинг проинсулина , в связи с чем у больных часто бывает повышено отношение проинсулин/инсулин в плазме. Если доля проинсулина превышает 20%, инсулинома весьма вероятна. Прием пероральных сахаропонижающих средств легко исключить, измерив сывороточные концентрации этих препаратов. Нормальное соотношение концентраций глюкозы и инсулина в плазме исключает гипогликемию, обусловленную печеночной недостаточностью и ИФР-секретирующими опухолями .

Инсулинома редко встречается у больных моложе 20 лет. Когда лабораторный диагноз инсулиномы установлен, опухоль визуализируют с помощью УЗИ, КТ или ангиографии поджелудочной железы .