Транскрипционный контроль гена ФНО был продемонстрирован в целом ряде работ, в которых с использованием run-on анализа было непосредственно показано, что ЛПС индуцирует повышенный уровень транскрипции гена ФНО в макрофагах ( Collart et. al., 1986 ; Jongeneel et. al., 1989 ; Sariban et. al., 1988 ).

Интересно, что хотя продукция ФНО в макрофагах активируется ЛПС более чем в 1000 раз, транскрипция гена по результатам этих работ активировалась всего в 2-3 раза.

Результаты с использованием более строгого количественного анализа ( Biragyn & Nedospasov, 1995 ) свидетельствуют о том, что уровень активации может быть выше - до 10 раз. Кроме того, в этой же работе показано, что индукция макрофагов ЛПС приводит к двум событиям в регуляции транскрипции гена ФНО:

1) увеличение количества молекул РНК-полимеразы II , инициирующих транскрипцию гена;

2) повышение процессивности транскриптов (т. е. транскрипционный комплекс более эффективно доходит до конца гена), что приводит к формированию значительного количества зрелой мРНК. Ранее было показано, что некоторые активаторы транскрипции могут вносить вклад одновременно в увеличение скорости инициации и уровня процессивности транскриптов ( Yankulov et. al., 1994 ). Поэтому естественно было предположить, что в обоих компонентах индуцированной транскрипции гена ФНО должны принимать участие активаторы транскрипции, сайты связывания которых расположены в регуляторных областях гена, в первую очередь - перед промотором.

Другой путь исследования активации транскрипции гена ФНО заключался в изучении транзиторной экспрессии гена-репортера (бактериальной хлорамфеникол-ацетилтрансферазы - CAT), помещенного под контроль промоторной области гена ФНО. Макрофаги или линии клеток миелоидного ряда трансфецировали подобными химерными конструкциями и измеряли уровень индукции транскрипции гена ФНО по активности продукта гена-репортера ( Shakhov et. al., 1990 ; Goldfeld et. al., 1991 ; Econoroou et. al., 1989 ; Hensel et. al., 1989 ; Rhoades et. al., 1992 ; Leitman. et. al., 1991 ; Drouet et. al., 1991 ; Leitman et. al., 1992 ; Kuprash et. al., 1993 ; Geist et. al., 1994 ; Fong et. al., 1994 ; Kronke et. al., 1994 ).

В ряде работ по данным функционального анализа 5'-делеционных мутантов промотора гена ФНО в макрофагальных линиях клеток был локализован ДНК участок , достаточный для индуцированной транскрипции гена ФНО человека форболовыми эфирами ( РМА ), который простирался до -285 пн относительно точки старта транскрипции. В разных работах необходимыми регуляторными элементами для индукции РМА предполагались либо сайты связывания транскрипционных комплексов АР-1 (- 66 пн), либо сайты связывания транскрипционных комплексов АР-2 (-36 пн) ( Rhoades et. al., et. al., 1992 ; Hensel et. al., 1989 ), либо сайты связывания ATF/CRE (-111 ПН), сайты связывания EGR-1 (-170 ПН) ( Kronke et. al., 1994 ), либо собственно ТАТА-бокс ( Leitman et. al., 1992 ). Также утверждалось, что сайт связывания транскрипционного комплекса ATF/CRE (-111 пн) обеспечивает аутоиндукцию гена своим белковым продуктом ( Leitman et. al., 1991 ). Некоторые из упомянутых выше сайтов связывания регуляторных факторов, а также сайты связывания комплексов семейства NF-kB/Rel (кВ2 (-627 пн) и kВ2а (-598 пн)) являются консервативными и присутствуют в соответствующих участках промотора гена ФНО мыши ( Рис. 2 ).

Тем не менее, функциональная характеристика регуляторных элементов промотора гена ФНО приводила к противоречивым результатам в мышиной и человеческой системах. Так, изучение ЛПС- активированной транскрипции гена ФНО мыши в макрофагах выявило основную функциональную значимость цис-действующих элементов промотора, с которыми взаимодействуют транскрипционные факторы семейства NF-kB/Rel ( Shakhov et. al., 1990 ; Drouet et. al., 1991 ). Было показано, что в промоторе гена ФНО мыши расположены четыре сайта связывания NF- KB/Rel (пятый сайт кВ2а в этих работах функционально не исследовался), аффинности связывания которых распределялись следующим образом: kBЗ >> kB >kB2 > kB4. Интересно отметить, что высокоаффинный сайт кВЗ неконсервативен и отсутствует в геномах других организмов. Мутации в каждом из сайтов снижали активность гена-репортера примерно в два раза. Мутации во всех четырех сайтах связывания NF-KB/Rel приводили к снижению активности гена-репортера в 10 раз. Тем самым, было предположено, что охарактеризованные регуляторные элементы, относящиеся к сайтам связывания транскрипционных факторов семейства NF-KB/Rel, играют центральную роль в активации транскрипции гена ФНО.

В работе ( Kuprash et. al., 1993 ) было показано, что, по всей видимости, основную роль в индуцированной ЛПС активации транскрипции гена ФНО мыши могут играть расположенные близко друг к другу консервативные сайты кВ2 и кВ2а и, возможно, дополнительные элементы, расположенные в районе -700 пн, а не высокоаффинный сайт кВЗ, как считалось ранее. В противоположность этому, работы по исследованию промотора гена ФНО человека в линиях клеток миелоидного ряда отрицали роль белков данного семейства в активации транскрипции гена, что косвенно подтверждалось отсутствием в промоторе гена ФНО человека высокоаффинного сайта связывания кВЗ ( Goldfeld et. al., 1991 ; Economou et. al., 1989 ).

Последующие работы, включая настоящее исследование, показали, что промотор гена ФНО имеет сложную модульную структуру (рис 6). Наличие регуляторных элементов в промоторе гена ФНО, определяющих взаимодействие с разными транскрипционными факторами, предполагает возможность его дифференциальной регуляции в разных типах клеток и в ответ на разные стимулы. Таким образом может обеспечиваться различный по силе биологический ответ, связанный с продукцией ФНО.

Интересно, что промоторы генов других цитокинов , продуцируемых макрофагами в ответ на бактериальную и другие инфекции (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8), также имеют сложную структуру, что, возможно, определяет организацию специфической реакции организма на чужеродные раздражители на уровне транскрипции соответствующих генов ( Hiscott et. al., 1993 ; Gray et. al., l 1993 ; Zhang & Rom, 1993 ; Cogswell et. al., 1994 ; Dendorfer et. al., 1994 ; Matsusaka et. al., 1993 ; Stein & Baldwin, 1993 ; Kunsch et. al., 1994 ; Oliveira et. al., 1994 ).