Карта белка нуклеозиддифосфаткиназы

EC 2.7.4.6

Рекомендуемое название: нуклеозиддифосфаткиназа. Другие названия: ATP - нуклеозиддифосфаттрансфосфатаза. Систематическое название: ATP: нуклеозиддифосфатфосфотрансфераза.

Фермент обнаружен у бактерий [ Lacombe M.L.,1990 ], дрожжей [ Palmieri R.,1973 ], у птиц [ Islam K.,1984 ], у млекопитающих [ Kimura N.,1988 ; Nickerson J.A.,1984 ; Hemmerich S.,1992 ], в том числе и у человека [ Cheng Y.-C.,1973 ; Gilles A.-M.,1991 ; Koyama K.,1984 ].

Фермент очищен до гомогенного состояния из цитозоля и митохондрий сердца быка [ Colomb M.G.,1969 ; Colomb M.G.,1972 ], печени быка [ Pedersen P.L.,1968 ], из микротубул мозга быка [ Robinson J.B.,1981 ], из плазматических мембран печени крысы [ Kimura N.,1988 ], из мозга свиньи [ Huitorel P.,1984 ], из эритроцитов человека [ Parks R.E.,1973 ] и растворимой фракции клеток асцитного рака Эрлиха [ Koyama K.,1984 ].

Из всех источников, за исключением клеток асцитного рака Эрлиха, фермент имел молекулярную массу 100-105 кДа и представлял собой гексамер.

Фермент из клеток асцитного рака Эрлиха, а также из линии тучных клеток слизистой оболочки соединительной ткани крысы [ Hemmerich S.,1992 ] представлял собой тетрамер 72-76 кДа.

Причины различия в олигомерной структуре фермента не ясны.

Из всех источников фермент проявлял гетерогенность по изоэлектрическим точкам, обнаруживая до шести молекулярных форм, имеющих pI от 5.4 до 8.3 [ Parks R.E.,1973 ; Cheng Y.-C.,1973 ]. Причины гетерогенности фермента связывают с результатом протеолиза [ Robinson J.B.,1981 ]., различной степенью фосфорилирования шести субъединиц [ Kimura N.,1988 ] или наличием различных ферментов, имеющих близкие физико-химические и каталитические свойства [ Parks R.E.,1973 ].

Не полностью выяснен вопрос о идентичности субъединиц нуклеозиддифосфаткиназы. Так, фермент из эритроцитов человека [ Presecan E.,1989 ] из раковых клеток линии Hola человека [ Yokoyama M.,1986 ], из клеток асцитного рака Эрлиха [ Koyama K.,1984 ] состоял из двух неидентичных субъединиц, имеющих близкую молекулярную массу 17-20 кДа. Фермент из мозга быка [ Nickerson J.A.,1984 ] скелетных мышц крысы [ Kimura N.,1990 ] и печени крысы [ Kimura N.,1988 ] состоял из идентичных субъединиц.

В 90-х годах было показано, что нуклеозиддифосфаткиназа из эритроцитов человека [ Gilles A.-M.,1991 ] представляет собой гексамер, содержащий два сорта субъединиц (А и В), которые путем случайной ассоциации могли образовывать изоферменты типа A₆; A₅;В₁; A₄B₂;A₃B₃; и т. д., отличающиеся между собой по величинам pI и кинетическим параметрам.

Обе субъединицы содержали 152 аминокислотных остатка и имели молекулярные массы 17,143 и 17,294 кДа для А и В соответственно. Субъединицы отличались между собой 18 аминокислотными остатками и были иммунохимически подобны, т.е., антитела, полученные против субъединицы А, взаимодействовали с субъединицей В, и наоборот [ Gilles A.-M.,1991 ].

Распределение изоферментных форм нуклеозиддифосфаткиназы типа А_хВ_х; в тканях не ясно, хотя растворимая нуклеозиддифосфаткиназа из скелетных мышц крысы идентична изоферменту В₆; [ Kimura N.,1990 ; Stahl J.A.,1991 ].

Для проявления активности нуклеозиддифосфаткиназа требует присутствия ионов Mg²⁺ . В присутствии Mg²⁺, Mn²⁺ и Co²⁺ активность фермента - максимальна; в присутствии Ca2+ в два раза ниже. Zn2+; и Cu2+; не активируют фермент [ Parks R.E.,1973 ].

Фермент проявляет широкую субстратную специфичность как к различным нуклеозиддифосфатам, выступающим в качестве акцепторов фосфатной группы, так и к нуклеозид- или дезоксинуклеозидтрифосфатам, выступающим в качестве доноров фосфатной группы [ Parcs R.E.,1973 ; Lascu I.,1991 ].

Реакция , катализируемая нуклеозиддифосфаткиназой подчинялась механизму "пинг-понга" [ Garces E.,1969 ] с обязательным фосфорилированием 1-N-гистидина-118 [ Walinder O.,1968 ; Gilles A.-M.,1991 ], и образованием высокоэнергетического фосфо-ферментного промежуточного соединения. В ранних работах было показано, что, только 3-4 моля Pi; могут включаться в гексамерную молекулу фермента из сердца быка [ Colomb M.G.,1964 ].

Для фермента из большинства источников показано, что каждая субъединица способна фосфориллироваться . Лишь нуклеозиддифосфаткиназа из тучных клеток слизистой оболочки крысы [ Hemmerich S.,1992 ], имеющая тетрамерную форму включала только две молекулы Pi.

Фосфорилирование субъединиц протекает не кооперативно [ Lascu I.,1991 ]. Каждая фосфорилированная и нефосфорилированная субъединица содержит два центра для связывания нуклеотидов: на первом центре прочно связывает ATP и, более слабо, нуклеозиддифосфаты, и на втором центре связываются нуклеозиддифосфаты [ Lascu I.,1986 ].

Связывание нуклеотидов на одном из центров посредством конформационных изменений в белковой молекуле приводило к изменению сродства нуклеотидов ко второму центру [ Lascu I.,1991 ].

Каталитические свойства субъединиц нуклеозиддифосфаткиназы эритроцитов человека [ Gilles A.-M.,1991 ] типа A и B отличаются между собой по величине Km и Vmax для нуклеозиддифосфата (например, для GDP Km равна 33 и 66 mМ и Vmax равны 550 и 740 Ед/мг белка для А6; и В6; соответственно.

Нуклеозиддифосфаткиназа, катализирующая перенос высокоэнергетического фосфата, участвует в различных биологических процессах и играет ключевую роль в функции клетки [ Lascu I.,1991 ].

Фермент, локализованный на внешней мембране митохондрий осуществляет связь между ATP, образующимся в результате окислительного фосфорилирования во внутреннем компартменте митохондрий, и использованием не адениновых нуклеозидтрифосфатов в биосинтезе биополимеров [ Pedersen P.L.,1978 ].

Фермент участвует в переносе высокоэнергетического фосфата от ATP путем "тунелирования" т.е. образования комплексов с ферментами, биологическая активность которых зависит от присутствия образующихся нуклеозидтрифосфатов. Такой перенос высокоэнергетического фосфата показан для фибробластов эмбриона китайского хомячка при синтезе ДНК, где выделен комплекс шести ферментов , включая ДНК-полимеразу-альфа ( КФ 2.7.7.7. ), рибонуклеозиддифосфатредуктазу ( КФ 1.17.4.1 ), тимидинкиназу ( КФ2.7.1.21. ), дигидрофолатредуктазу ( КФ 1.5.1.3. ) тимидилатсинтазу ( КФ 2.1.1.45 ) и нуклеозиддифосфаткиназу [ Reddy G.P.,1980 ].

Близкий комплекс был выделен из лимфобластоидных клеток человека[ Wickremasinghe R.,1983 ] и из пациентов, страдающих острой лимфобластоидной лейкемией [ WickremasingheR.,1982 ].

"Тунелирование" высокоэнергетического фосфата обнаружено в процессе синтеза t-РНК (комплекс нуклеозиддифосфаткиназы с t-РНК-аденилилтрансферазой КФ 2.7.7.25 ) [ Sato N.L.,1987 ], в процессе образования микротрубочек мозга (тубулин-GDP является субстратом фермента) [ Penningroth S.M., 1977 ; Huitorel P.,1984 ], в процессе биосинтеза белка (перенос GTP на фактор элонгации альфа1 ) [ Wertheimer A.M.,1977 ; Ohtsuki K.,1987 ].

Нуклеозиддифосфаткиназа стимулирует связывание Met-t РНК c 40S рибосомами в процессе синтеза белка [ Roy R.,1984 ].

Фермент в комплексе с ATP-зависимой сукцинат-CoA-лигазой ( КФ 6.2.1.5 ) из митохондрий сердца кролика включен в перенос высокоэнергетического фосфата от GTP, образующегося в цикле Кребса в пул ATP [ Kadrams E.F.,1991 ].

Нуклеозиддифосфаткиназа, связанная с мембраннами печени крысы участвует в активации гормон-зависимой аденилатциклазы ( КФ 4.6.1.1. ) [ Kimura N.,1988 ; Kimura N.,1983 ; Kimura N.,1988a ].

Гуаниновые нуклеотиды строго необходимы для регуляции гормонами аденилатциклазной системы [ Kimura N.,1977 ].

Связанная с мембранами нуклеозиддифосфаткиназа образует комплекс с Gs-белком , локализованным на поверхности цитоплазматической мембраны [ Kaslow H.R.I.,1980 ], прочность которого регулируется гуаниновыми нуклеотидами или различными гормонами в присутствии гуаниновых нуклеотидов, предполагают, что нуклеозиддифосфаткиназа может быть четвертым компонентом аденилатциклазной системы [ Kimura N.,1988a ].

Выделен близкородственный белок, синтезируемый на гене Nm23 H2 человека [ Stahl J.A.,1991 ], который был идентичен субъединице B нуклеотиддифосфаткиназы эритроцитов человека. Обе Субъединицы А и В (белки Nm-23 H1; и Nm-23 H2) N-концевой аминокислотной последовательности содержали 2-3 молекулы лейцина в периодической последовательности, что предполагает наличие лейцинового зиппера , характерного для белков, связывающихся с ДНК [ Landschultz W.H.,1988 ], а также для белок-белкового связывания, найденного в онкогенах и факторах транскрипции.

Синтез фермента в раковых клетках человека линии Hela индуцировался интерфероном человека; интерферон мыши на синтез фермента линии клеток Hela не влиял [ Ohtsuki K.,1986 ]. У человека субъединицы А и В клонированы [ Rosengard A.M.,1989 ; Stahl J.A.,1991 ; Gilles A.-M.,1991 ].

Субъединица В фермента человека [ Stahl J.A.,1991 ] на 97% идентична растворимой нуклеотиддифосфаткиназе крысы [ Kimura N.,1990 ].

У крысы растворимый фермент подвергался посттранскрипционному процессингу (ограниченному протеолизу и дальнейшей модификации образующейся альфа-NH2-группы нового аминокислотного остатка) и содержал 147 аминокислотных остатка с молекулярной массой 16,724 кДа [ Kimura N.,1990 ].

Субъединыцы А и В эритроцитов человека и белки белки Nm-23 H1; и Nm-23 H2; содержали 152 аминокислотных остатка с молекулярной массой 17,143 и 17,294 кДа, имели гомологию между собой на 88% и отличались 18 аминокислотными остатками [ Gilles A.-M.,1991 ; Stahl J.A.,1991 ].